一、蛋白质印迹（Western Blot, WB）

    又称为免疫印迹（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中分子量大小不同的蛋白分开，然后通过电转移的方法将凝胶中的蛋白转移到固相膜上，再利用抗原、抗体的特异性结合反应，特殊的抗体标记技术以及相应的检测方法，进而对目的蛋白进行定性、相对定量检测的技术。

二、Western Blot用途

• 检测目标蛋白有无、大小
• 检测处理后目标蛋白的表达量变化
• 检测目标蛋白在不同的细胞或组织中的表达量差异

三、Western Blot实验流程

四、样本制备

详情戳链接↓↓↓

Western Blot技术讲解——样本制备篇

五、电泳分离

详情戳链接↓↓↓

Western Blot技术讲解---电泳分离篇

六、转膜

详情戳链接↓↓↓

Western Blot技术讲解---转膜篇

七、封闭

封闭对于防止转移的蛋白质、膜和实验中使用的后续试剂之间的非特异性相互作用至关重要。在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。

所以Western blot的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

常见封闭液的种类：

1、牛血清白蛋白（BSA）

牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，非常常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。但大家也可以根据自己实验的需要来改变浓度，因为价格比较高，所以很多研究⼈员都是用尽可能低而有效的浓度。虽然BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，但是提纯过程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号。

2、脱脂奶粉

最便宜而且最好买的封闭剂就属脱脂奶粉了。无论是从化学制品公司还是从超市购买，都可以直接拿来使用。通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。此外，因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。

3、商品化封闭液

通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素等其他封闭液中难以避免的成分。当然，价格也就更贵。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题。

封闭的条件：

室温或者 37℃缓慢摇荡1～2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

总的来说，没有适用于所有体系的封闭液，但是封闭液的选择基于3样事情：抗原、抗体、检测系统。想找到适合⾃⼰⽬标蛋⽩的封闭液，并不简单。除了排出⼀些很明显不合适的，剩下的就需要多花点时间尝试不同种类、不同浓度的封闭液，才能找到最适合的。

（以上内容来自于网络，如有侵权联系即删除。）

我们推荐思科捷蛋白定量制剂相关产品，帮您更好地完成实验。

Sparkjade^®是山东思科捷生物技术有限公司旗下为科研工作者提供创新型产品及专业技术服务的品牌。Sparkjade^®拥有分子生物学、小分子化合物、免疫学、细胞生物学、实验耗材五个系列产品，为科研工作者提供优质产品与专业的技术服务。