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之前的文章中星博士给大家介绍了有关Western Blot实验的原理及实验操作过程中一些需要注意的细节等相关知识。但是依旧有小伙伴在结果图片出来之后满面愁容，实验结果还是不够理想，为了让小伙伴们在得到结果之后有的放矢，接下来，星博士将带领大家对WB实验结果中的一些常见问题进行分析，给大家提出对应的解决方案供大家选择，帮助大家逐一击破难题，为大家得到理想的WB实验结果保驾护航！
"Western Blot实验的步骤很简单，但是也会出现许多问题，导致意想不到的结果。星博士对这些结果进行了汇总，总结出以下五大结果问题："
（1）非特异性条带或异常条带，
（2）无条带，
（3）背景高，
（4）出现空泡或斑点等，
（5）条带变形。
那么接下来，针对这五大问题，星博士将给大家进行一一分析，提供解决方案，供大家参考！
WB实验结果中常见问题及对策
（1）非特异性条带或异常条带
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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一抗的非特异性结合 |
更换一抗 |
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蛋白样品发生降解，蛋白酶将蛋白样品分解成若干小蛋白，降解后的蛋白同样可以被一抗识别 |
样品处理过程中，添加酶抑制剂 |
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目的蛋白有多个修饰位点可与一抗结合 |
更换一抗 |
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目的蛋白本身存在修饰或者剪切，导致条带异常 |
查找文献，确定蛋白性质 |
（2）无条带
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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样品处理中蛋白发生降解 |
添加酶抑制剂 |
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蛋白本身表达丰度很低 |
加大上样量，或提高蛋白浓度 |
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转膜时间太短或者太长 |
选择合适的转膜时间 |
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一抗的特异性不好，不能识别目的蛋白 |
更换品质更好地一抗 |
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洗脱时将目的蛋白洗掉 |
选择合适的吐温浓度，控制洗脱时间 |
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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抗体浓度太高 |
降低抗体浓度，选择合适浓度的抗体 |
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洗膜时间或次数不够，清洗不干净 |
延长洗膜时间，增加洗膜次数 |
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封闭时间不够 |
建议37度封闭1h以上，4度过夜 |
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封闭液选择不当 |
根据蛋白需求选择合适的封闭液 |
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封闭液用量不足，没有覆盖整张膜 |
加大封闭液的量，保证整张膜覆盖 |
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抗体孵育温度过高 |
建议4度过夜孵育 |
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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出现空泡：转膜过程中，胶与膜中间有气泡产生 |
在制作‘三明治’结构时，尽量赶走气泡，避免气泡产生。夹层之间填充合适厚度的滤纸，保证结构稳定紧实 |
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出现黑斑黑点：封闭液溶解不完全，且未经过滤，导致封闭液中有固体块 |
配制封闭液后，充分搅拌混匀，过滤后使用 |
（5）条带变形
条带牵手
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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上样量太大，导致蛋白积压 |
降低上样量 |
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分离胶浓度太小，小蛋白弥散 |
提高分离胶浓度 |
条带拖尾
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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样品溶解效果不佳 |
样本裂解后离心 |
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分离胶浓度过大 |
降低分离胶浓度 |
条带“微笑”
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原因分析 |
推荐解决方案 |
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中间部分胶凝固不均匀 |
待充分凝固后在做后续实验 |
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电泳温度过高（改变了pH值和迁移速率） |
降低电泳温度（冷库或冰上） |
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迁移过快 |
降低迁移速率 |
条带“哑铃型”
原因分析
推荐解决方案
转膜的时候三明治夹得太紧了，把胶夹扁了
适当降低滤纸张数
胶凝固不均一
使用高品质的胶进行实验
样品中杂质太多，杂质沉淀在孔中间
对样品进行离心处理，取上清
Tel：400-6947-688
联系我们！
思科捷有专业的科研团队，有耐心的老师讲解，还有不定期的知识讲座，在助力科研的道路上，只有你想不到，没有我们做不到。只要是实验中遇到了问题，星博士都将竭力为大家解决，为大家得到完美的实验结果保驾护航~关注星博士，为实验助力，为结果添彩！
